多细胞生物中不同细胞类型共享相同的基因组，但由于基因的差异调控而形成高度特化的细胞功能。候选顺式调控元件 (cCREs) 包括启动子、增强子和绝缘子，通过提供转录因子（TFs）的结合位点，在基因调控中起关键作用。通过解读TFs及其相应cCREs在物种间的保守基因组调控模式，可以深入了解细胞类型演化。尽管已有工作通过单细胞转录组测序（single cell RNA-seq，scRNA-seq）识别了多个物种的细胞特异TFs，但低表达水平的TFs的检测仍受技术和成本限制，并且限制了TF调控网络的探索。单细胞染色质可及性测序 （single cell ATAC-seq，scATAC-seq）可以提供与转录组互补的表观调控信息，有助于我们更为深刻地理解跨物种的保守调控机制。人、小鼠的全身多组织染色质可及性景观已经相继问世，但其它模式生物如斑马鱼、果蝇和蚯蚓仍缺乏全身染色质可及性景观。
2024年2月8日，浙江大学基础医学院/良渚实验室郭国骥教授团队在Development Cell上在线发表了题为“Construction of Single-Cell Cross-Species Chromatin Accessibility Landscapes with combinatorial-hybridization-based ATAC-seq”的研究论文，开发了一种基于组合杂交的高通量、低成本、高信噪比的单细胞染色质可及性测序技术CH-ATAC-seq，构建了低等物种包括斑马鱼，果蝇，蚯蚓的全身染色质可及性景观，并阐述了跨物种基因和调控元件的保守和多样性特征。
CH-ATAC-seq是一种基于组合杂交的单细胞染色质可及性技术。首先，细胞核在4个96孔板内经过转座反应打上第一轮共384种标签。然后，细胞核被收集混匀并均匀分布到新的96孔板进行杂交反应，并引入第二轮共768种标签。最后，细胞核再次收集并分布到96孔板进行PCR反应，引入最后一轮共384种标签。理论上，单次实验可以处理百万级别的细胞核，并且多个样本可以进行通过第一轮标签进行标记后混到一起处理，大大减少了样本间的批次效应（图1）。本研究生成了基于CH-ATAC-seq平台的小鼠数据，并与已发表的sci-ATAC-seq的小鼠肾脏数据进行比较，结果发现CH-ATAC-seq具有明显更高的转录起始位点（TSS）富集分数，表明CH-ATAC-seq数据具有更高的信噪比。
CH-ATAC-seq实验原理流程
基于CH-ATAC-seq测序平台，本研究构建了成年斑马鱼、果蝇、蚯蚓的全身染色质可及性景观，总共得到~550000高质量细胞核。为了验证细胞类型注释的准确性，利用相同物种的scRNA-seq数据进行标签转移。最后，分别对每个物种的差异peak富集，利用HOMER工具进行了motif的从头富集。结果显示，富集到的motif能较好地对应细胞类型特异功能。
为了系统性地进行跨物种细胞类型的比较分析，本研究收集了已发表的人、猴和小鼠的单细胞染色质可及性景观数据，并进行了上游的数据统一处理，最终得到了152种主要细胞类型以及约80万个细胞类型特异的cCREs。随后，以人的基因组为参考，基于liftOver工具，将小鼠和斑马鱼的peak进行分类，包括：序列水平上无法与人基因组的区域对齐的UA元件；可以对齐到人基因但并非在两个物种都开放的A元件；以及既序列保守又在两个物种中同时开放的CA元件。CA元件被认为是序列和功能同时物种间保守的调控元件，具有显著更高的Phylop保守分数，并且这些元件高度富集在TSS区域。表明启动子序列在细胞类型的进化中具有更高的选择压力，从而保留细胞类型特异的功能。
随后，基于SAMap算法，本研究对6个物种的染色质可及性图谱进行了跨物种分析，结果表明神经和肌肉细胞展示了物种间高度保守性。另外，在细胞谱系水平上通过分析跨物种保守的TFs，发现上皮细胞显示出了明显的组织特异性。
最后，结合6个物种的单细胞转录组数据，作者利用SENIC+进行了调控网络的重构，鉴定出了谱系特异TF以及对应的TF靶向区域和TF靶向基因。与TF靶向区域相比，TF靶向基因具有相对高的保守程度。值得一提的是，虽然不同物种的TF靶向基因保守程度不高，但它们都能富集到细胞类型特异的功能。
总的来说，本研究开发了新一代的染色质可及性技术——CH-ATAC-seq，并通过在物种层面上首次构建跨物种染色质可及性分析，深入了对细胞类型的保守性和多样性的理解（图2）。此外，本研究为遗传学和进化生物学提供了宝贵数据资源和研究途径。
分析流程图
浙江大学基础医学院博士生张国栋、博士生傅雨婷、博士生杨蕾、博士后叶昉和博士后张霈婧为本文共同第一作者。浙江大学基础医学院/良渚实验室郭国骥教授、良渚实验室王晶晶研究员、浙江大学基础医学院韩晓平教授为本文的通讯作者。本研究获得了国家重点研发计划、国家自然科学基金、国家创新团体计划的支持。
