【科学人谈科学】超分辨显微：突破衍射极限，向纳米分辨进军
    主讲人：光电信息工程学系超分辨光学显微实验室副教授匡翠方
    
    衍射极限
    
    我们能看到什么？看到多小的范围？看得有多清楚？几百年来，依靠不断进步的科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以看得越来越“小”，进而可以进行研究。
    
    人的肉眼能分辨0.1毫米尺度的物体，再小，就要借助工具。1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究的光学显微镜，用它观察薄薄的软木塞切片。虎克看到了残存的植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一起，这就是“细胞”一词的由来。
    
    此后，显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，帮助科学家第一次发现了细菌和微生物。那么，光学显微镜是否可以无止境地“放大”下去，让我们想看到多小就能看到多小？科学家为此做了很多尝试，最终发现，存在一道法逾越的“墙”———衍射极限。
    
    1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光是一种电磁波，由于存在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后，不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近，弥散斑就叠加在一起，我们看到的就是一团模糊的图像。
    
    阿贝提出，分辨率的极限近似于入射光波长的二分之一(d=λ/2)。可见光的波长通常在380~780纳米之间，根据衍射极限公式，光学显微镜的分辨率极限就在200纳米（0.2微米）左右。如果物体小于0.2微米，你仍旧看到的是一个模糊的光斑。这就是很长一段时间内，光学显微镜的分辨极限。
    
    这就是为什么后来有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备，人们借助它们可以看得更“细”。那么，这些设备有没有突破衍射极限呢？他们依然遵循着阿贝衍射极限。这些设备的使用的是电子束等波长非常短的入射光，自然，它们的分辨率就高。比如电子显微镜，分辨率可以达到0.5埃（一埃等于十分之一纳米），这样就可以看到一粒一粒的原子。
    
    突破衍射极限
    
    那么，光学显微镜是否已经完成它的使命，可以退出历史舞台了呢？目前，光学显微镜的研发还是世界科学家的研究热点。生物学、医学方面的研究，更希望在生命体存活的自然状态下进行观察，在这方面，光学显微镜有它不可比拟的优势。突破性的进展发生在本世纪初，一个是德国哥根廷大学的StefanHell教授提出的STED方法，一个是哈佛大学的庄小威提出的STORM方法。
    
    STED的方法可以理解为“以光制光”。用另外一束环状的光“叠加包围”原有的光斑，这样，原有的光斑的外围部分会得到削弱，我们看到的就是更小的聚焦的点，这样就会提高分辨率。采用这种方法的光学显微镜，分辨率可以达到30~50纳米，可以清晰地看到细胞内部的微管。
    
    2006年，哈佛大学庄小威从化学生物学角度提出了她的新方法，利用荧光探针家族，实现了多色随机光学重建显微法（multicolorstochasticopticalreconstructionmicroscopy）。她的核心原理是利用光线“开关”，“随机”地让被观测物体上的点发光或熄灭，这样就拉远了两个发光点之间的距离，相机不断动态捕捉这样的成像，再经过计算机分析，就会形成被观测物体整体的图像。这种方法，把光学显微镜的成像推进到20-30纳米级别的分辨率，在《Science》杂志上，课题组演示了DNA模式样品和哺乳动物细胞的多色成像。
    
    以上这些进展,都让光学显微镜突破了衍射极限，我们称之为“超分辨成像技术”。美国光学学会把它列为21世纪光学五大研究计划之首。
    
    我们的原创进展
    
    我们超分辨光学显微课题组在刘旭教授的带领下，很多年前就开始了超分辨成像技术的相关研究，在超分辨成像两个主要分支上有了原创性进展。比如，我们搭建了国内首套门控荧光受激发射损耗(g-STED)光学显微系统，它的基本原理与STED相似，但我们用了门控的方法，控制了“拍照”时间，这样，它的空间分辨率可以达到38纳米(~λ/14)，在此基础上，我们又加入了微分方法进行优化，这样，分辨率还能进一步推进。在STORM这一分支，我们也给出了部分光点“随机”呈现的另外一种方法：荧光自行消退的过程中，本身就是一个随机的过程，我们将这一过程不同时期的照片做一个叠加分析和处理，便可以得到一幅清晰的、真实的、完整的图像。
    　　当前很多生物学、医学方面的研究都会使用荧光标记，无论是STED还是STORM，观测的都是被荧光标记过的细胞结构。那么没有荧光标记的情况下，是否可以进行“天然”地超分辨观察？这方面，我们也在探索，是否能够通过被观测物体的折射率来进行分析，目前，我们已经在实验上提出了~λ/7分辨率的显微装置。
    
    浙江大学的学科很齐全，我们经常和生仪学院、医学院的教授聚在一起，听听他们在研究上的需求。目前，在生物和医学研究应用比较广泛的光学显微镜是共聚焦显微镜，而分辨率比它更高的超分辨显微镜，我国还只有个别研究机构有。最近，我们打算把我们搭建的g-STED光学显微系统送到医学院段树民教授的实验室，供科学家们使用。我们同时希望这一成果能很好地向产业界转化，我们与宁波永新光学股份有限公司合作申请了宁波市科技创新团队项目。
    
    再回到科学，诺贝尔奖物理奖曾两次颁给显微镜设计领域的科学家，1953年诺贝尔颁给了发明相衬显微镜的泽尔尼克，这种显微镜适用于观察具有很高透明度的对象；1986年一半授予德国的恩斯特·鲁斯卡,他设计了第一架电子显微镜；另一半则授予了设计出扫描隧道显微镜的鲁西利康和罗雷尔。那么，突破衍射极限的超分辨电子显微镜的发明会不会获奖呢？现在还很难说，这要看这一技术是否真正对生物学、医学等领域的研究产生了变革性的推动了。希望超分辨显微技术能帮助纳米工程、生物工程、医学、材料学等相关研究领域科学家获得更多的发现。
    
    （周炜）